使用奧林巴斯CX33正置顯微鏡拍攝野生線蟲身體運動模式，需結合顯微鏡功能特性與線蟲觀察需求進行操作優化，以下是具體分析：

一、奧林巴斯CX33正置顯微鏡核心功能適配性

成像系統

CX33配備無限遠光學系統與平場消色差物鏡（4x-100x），可清晰呈現線蟲體表結構（如肌肉條紋、神經環）及運動細節。10x目鏡（視場數FN=20）與40x物鏡組合可實現400倍放大，滿足線蟲體長（通常0.5-2mm）的觀察需求。

建議：若需更高分辨率，可搭配100x油鏡（NA=1.25），但需注意線蟲活性可能因高倍率下視野變暗而降低。

照明與對比度

LED光源：色溫穩定（6萬小時壽命），避免傳統鹵素燈發熱導致線蟲應激反應。

聚光鏡調節：阿貝聚光鏡（NA=1.25）配合孔徑光闌，可優化薄而透明的線蟲樣本對比度。對于線蟲觀察，建議降低光源亮度并縮小孔徑光闌，以增強體表細節對比。

示例：觀察秀麗隱桿線蟲時，將亮度調至30%-50%，孔徑光闌調至與物鏡NA值匹配（如40x物鏡對應NA=0.65）。

載物臺與操控

機械固定載物臺：行程X×Y=76mm×52mm，適合追蹤線蟲運動軌跡。

低位對焦旋鈕：減少手臂移動，提升長時間觀察舒適度。

操作技巧：使用載物臺移動旋鈕微調位置，避免直接觸碰載玻片導致線蟲逃逸。

二、奧林巴斯CX33正置顯微鏡線蟲樣本制備與觀察流程

樣本制備

培養基選擇：將線蟲轉移至NGM培養基或M9緩沖液滴片，厚度控制在0.1-0.2mm，避免樣本過厚導致成像模糊。

麻醉處理：若需固定線蟲，可添加少量NaN?（終濃度0.01%）或左旋咪唑（終濃度1mM），但會抑制自然運動，需權衡利弊。

注意：野生線蟲活性較高，建議觀察時間控制在10分鐘內，或使用低溫環境（4℃）短暫降低活性。

顯微鏡操作

對焦與調光：

使用4x物鏡快速定位線蟲，切換至10x或40x物鏡后微調焦距。

調節聚光鏡高度至工作距離（如40x物鏡對應WD=0.6mm），優化照明均勻性。

運動模式記錄：

連續拍攝：連接數碼相機（如DP27），設置幀率10-30fps，記錄線蟲正弦波運動軌跡。

延時攝影：每5-10秒拍攝一幀，分析長時間運動模式（如趨化性、避光性）。

數據分析

軌跡追蹤：使用ImageJ插件（如Manual Tracking）記錄線蟲身體彎曲角度、波長及頻率。

行為分類：區分線蟲的探索行為（大范圍擺動）與定向運動（直線前進）。

三、奧林巴斯CX33正置顯微鏡的優勢與局限性

優勢

人體工學設計：45°傾斜目鏡與低位旋鈕減少疲勞，適合長時間觀察。

多功能載物臺：兼容血球計數板等附件，可同時觀察線蟲群體行為。

成像穩定性：LED光源無頻閃，適合視頻錄制。

局限性

無熒光模塊：若需觀察GFP標記的線蟲，需升級至CX43或搭配外置熒光光源。

低倍率限制：4x物鏡視野較大，但線蟲細節可能不清晰；高倍物鏡（如100x）需頻繁調焦。

解決方案：結合明場與暗場觀察，暗場模式下可增強線蟲輪廓對比度。

四、奧林巴斯CX33正置顯微鏡典型應用場景

基礎研究：分析線蟲趨化性（如對CO?、溫度梯度的響應）。

教學演示：展示線蟲正弦波運動機制，輔助神經生物學教學。

藥物篩選：觀察藥物對線蟲運動能力的影響（如麻痹、興奮效應）。