類器官（Organoid）是由干細胞或組織碎片在體外三維培養條件下自組織形成的微型器官模型，能夠模擬體內器官的結構和功能。其培養實驗流程涵蓋細胞獲取、三維培養體系構建、誘導分化、功能驗證及長期維護等關鍵步驟。以下是詳細的類器官培養實驗流程及注意事項：
一、實驗前準備
1.材料與試劑
細胞來源：成體干細胞（如腸道隱窩干細胞、肝祖細胞）、誘導多能干細胞（iPSCs）或胚胎干細胞（ESCs）。
培養基：基礎培養基（如Advanced DMEM/F12）補充生長因子（EGF、Noggin、R-spondin1等）、抗生素（青霉素/鏈霉素）、谷氨酰胺及B27補充劑。
基質膠：Matrigel或人工合成水凝膠（如Geltrex），用于提供三維支撐。
其他試劑：膠原酶、Dispase、TrypLE（細胞消化液）、PBS、4%多聚甲醛（固定液）。
2.設備與耗材
細胞培養箱（37℃、5% CO?）、低溫離心機、顯微鏡、移液器、24孔/48孔培養板、無菌操作臺。
二、類器官培養實驗流程
1. 細胞獲取與分離
成體干細胞分離（以腸道類器官為例）：
組織處理：取小鼠或人腸道組織，用PBS沖洗后剪碎，加入膠原酶（2 mg/mL）或Dispase（1 U/mL）37℃消化30-60分鐘，直至形成單細胞懸液。
隱窩分離：通過密度梯度離心或過濾（70 μm濾網）分離腸道隱窩，隱窩是類器官形成的起始單位。
iPSCs/ESCs分離：
從已建立的干細胞系中消化獲取單細胞，懸浮培養形成胚胎體（Embryoid Bodies, EBs），再誘導分化為特定譜系細胞。
2. 三維基質膠包被
基質膠準備：將Matrigel于4℃解凍，按1:10比例與預冷的基礎培養基混合（避免氣泡產生）。
包被培養板：每孔加入50-100 μL基質膠混合液，37℃孵育30分鐘使其凝固，形成三維支撐結構。
3. 類器官接種與初始培養
細胞接種：將分離的隱窩或干細胞（500-1000個/孔）懸浮于50 μL培養基中，均勻滴加至基質膠表面，37℃靜置15分鐘使細胞沉降。
覆蓋培養基：輕柔加入預熱的完全培養基（500 μL/孔），避免沖散細胞。
4. 誘導分化與培養基更換
分化條件：根據器官類型調整培養基成分：
腸道類器官：補充EGF（50 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）、R-spondin1（500 ng/mL）促進隱窩增殖。
肝類器官：添加HGF（20 ng/mL）、Oncostatin M（10 ng/mL）誘導肝芽形成。
腦類器官：使用無血清培養基（Neurobasal）補充FGF2、BDNF，促進神經分化。
培養基更換：每3-4天半量更換培養基，避免類器官脫離基質膠。
5. 類器官擴增與傳代
傳代時機：當類器官直徑達200-500 μm時（約7-14天），需進行傳代以維持活性。
傳代步驟：
吸除舊培養基，用冷PBS沖洗2次。
加入基質膠消化液（如Dispase，2 mg/mL）37℃孵育20-30分鐘，直至基質膠溶解。
收集類器官至15 mL離心管，500×g離心5分鐘，棄上清。
用TrypLE或Accutase于37℃消化5-10分鐘，形成單細胞或小團塊。
離心后重懸于新鮮基質膠中，按1:3比例傳代至新培養板。
6. 功能驗證與檢測
形態學觀察：顯微鏡下記錄類器官生長情況（如腸道類器官的囊狀結構、肝類器官的膽汁管形成）。
免疫熒光染色：檢測器官特異性標記物（如腸道類器官的LGR5、肝類器官的HNF4α）。
功能分析：
腸道類器官：檢測刷狀緣酶活性（如堿性磷酸酶）。
肝類器官：測定白蛋白分泌量或尿素合成能力。
腦類器官：評估電生理活性（如鈣成像）或神經元突觸形成。
三、關鍵注意事項
1.無菌操作：全程在無菌操作臺中進行，避免細菌/真菌污染。
2.基質膠質量：使用低生長因子基質膠，避免干擾類器官分化。
3.溫度控制：基質膠需4℃保存，解凍后分裝使用，防止反復凍融。
4.細胞密度：接種密度過高會導致營養競爭，過低則難以形成類器官。
5.分化因子濃度：需根據類器官類型優化生長因子組合（如Wnt通路激活劑對腸道類器官至關重要）。
四、應用場景
疾病模型：構建腫瘤類器官（如結直腸癌、胰腺癌）用于藥物篩選。
再生醫學：研究肝、腎類器官的移植潛力。
發育生物學：解析器官發生機制（如腦類器官模擬皮質層形成）。
毒理學測試：評估化學物質對器官的毒性效應。
五、常見問題與解決方案
類器官不形成：檢查基質膠是否凝固完全，或調整細胞接種密度。
生長緩慢：補充生長因子或更換新鮮培養基。
污染：立即丟棄污染培養物，徹底消毒操作臺。
傳代后死亡：優化消化時間，避免過度機械損傷。
通過規范化的實驗流程與嚴格的質量控制，類器官培養可高效模擬體內器官的生理與病理狀態，為生物醫學研究提供強大的體外模型。
